Conjuntivitis alérgica Tratamiento con alcaftadina

La conjuntivitis alérgica (aguda o crónica) llega a afectar a más de 20% de la población en general,^1,2 aunque con diferentes grados de manifestación de acuerdo con la hipersensibilidad de la respuesta inflamatoria a un alergeno que activa los mastocitos, basófilos, eosinófilos y otros mediadores.³

Los alergenos, su dilución en la película lagrimal, la expresión de las moléculas de adhesión por las células epiteliales y otros factores ambientales y fisiológicos dictan el inicio y la magnitud de la respuesta alérgica. Como afectan el paso de membrana, donde las proteínas de los alergenos se cruzan con la IgE e incitan la cascada alérgica, en estos procesos también está la solución antialérgica.

Epitelio conjuntival: uno de los elementos protectores de la supeficie ocular que debe vencer un alergeno para causar la conjuntivitis alérgica son las uniones herméticas del epitelio conjuntival, que son complejos de proteínas de membrana que se adhieren a los citoesqueletos de las células epiteliales adyacentes para su adhesión y estabilidad, como la ocludina y la claudina, dos proteínas de transmembrana que forman un escudo selectivamente permeable y que regulan el transporte paracelular.⁴ En una conjuntiva sana, estas uniones son casi que una barrera impermeable y solo permiten el paso de nutrientes y agua, mas no de toxinas, microorganismos y alergenos.

En una conjuntiva enferma, se reduce la función y organización de las uniones herméticas y se interrumpe la expresión de sus proteínas, comprometiendo la función de vigilancia del acceso de la capa epitelial,⁵ que de acuerdo con algunos estudios, afecta las alergias. Se sabe que muchos alérgenos comunes afecten a las proteínas clave de las uniones herméticas. Es el caso del polvo de la arena de las cajas de los gatos, que contiene enzimas proteolíticas que se descomponen en ocludinas, como la zonula occluompen en dens 1 (ZO-1) y que segmentan las uniones herméticas aumentando la permeabilidad epitelial.⁶ Las peptidasas de muchas especies de polen degradan, directa o indirectamente, estas uniones herméticas epiteliales, de acuerdo con estudios hechos con inmunofluorescencia.⁷

Al comparar pacientes con conjuntivitis alérgica estacional y controles normales, los primeros muestran una depleción de las proteínas de adhesión celular epitelial y de los elementos del citoesqueleto.⁵

Igual sucede con los corticoides, que aunque son efectivos para tratar alergias crónicas, no se usan en primera instancia para tratar la conjuntivitis alérgica⁸ por sus efectos secundarios (riesgo de glaucoma). Estos fármacos ejercen un efecto estabilizador sobre las uniones herméticas y la permeabilidad epitelial.^9,10

Otro medicamento antialérgico es la alcaftadina, un antihistamínico con actividad antiinflamatoria que alivia la infiltración de eosinófilos,^11-14 con alta afinidad para los receptores H1 y H2 de la histamina y antagonismo in vitro a los receptores H4. Por todo esto, se cree que la alcaftadina tiene propiedades diferentes a otros antihistamínicos, por ello se compararon los efectos de la alcaftadina al 0,25% con un control activo (olopatadina al 0,1) para determinar la expresión de las proteínas clave de las uniones herméticas con un modelo animal (ratón) de conjuntivitis alérgica.

Luego, con microscopía confocal se determinó la expresión de dos proteínas de adherencia, ZO-1 y E-cadherina en los ojos de los ratones expuestos al alérgeno, con y sin tratamiento. Además, en todos los grupos se midió la amplitud de la agregación de eosinófilos 

Método

– Clasificación: se dividieron aleatoriamente los 80 animales en cinco grupos terapéuticos:

1. NS/NC: sin experiencia previa (sin sensibilización, sin exposición).
2. S/C: sensibilizados, expuestos (sin tratamiento).
3. Vehículo: sensibilizados, expuestos y tratados con vehículo (Placebo).
4. Olopatadina al 0,1%: sensibilizados, expuestos y tratados con olopatadina (Control activo).
5. Alcaftadina al 0,25%: sensibilizados, expuestos y tratados con alcaftadina (Tratamiento experimental).

El grupo NS/NC sirvió de control para evaluar los efectos de la exposición, mientras que el grupo vehículo sirvió de control para asegurar que cualquier efecto observado por fuera de los dos grupos terapéuticos se debía a los agentes activos. (Ver Tabla 1)

Una vez se realizaron los tratamientos experimentales, se sacrificaron los animales y se removieron los tejidos para los ensayos.

• Sensibilización (días 1-14): se instilo el antígeno directamente a los ojos de los animales para obtener una respuesta.
• Exposición (días 28-30): a las cuatro semanas de haber iniciado la sensibilización, se expusieron los ratones bilateralmente con polen purificado por tres días consecutivos. Después de la última exposición, se guardaron las respuestas clínicas de los primeros 30 minutos y se buscaron los síntomas de conjuntivitis alérgica.
• Posología (días 28-30): los animales se trataron los últimos tres días del estudio. Un ojo recibió placebo y el otro alcaftadina dos horas y una hora antes de las exposiciones finales. El grupo de la fase tardía recibió dos dosis más, una y dos horas después de la última exposición y antes de sacrificar el animal a las 24 horas.
• Evaluaciones de fase temprana: los ojos de este grupo se analizaron para analizar la densidad de los mastocitos. Después de la exposición final al alergeno, se evaluaron los síntomas de los ratones después de exponerse al alérgeno, la cantidad de veces que entrecerraron los ojos o se lavaban la cara. También se evaluó el edema conjuntival y palpebral, la hiperemia y la epífora. La calificación clínica acumulada se calculó como la suma de los valores de cada uno de estos cuatro parámetros (0-16).¹⁵
• Evaluaciones de fase tardía: los ojos de este grupo se analizaron para analizar la infiltración de eosinófilos, anticuerpos y las proteínas ZO-1 y E-cadherina. Los ratones del grupo de fase tardía se sacrificaron a las 24 horas de la última exposición al alérgeno conjuntival.

Resultados

– Evaluaciones de fase temprana: la sensibilización y la exposición aumentaron significativamente los signos y síntomas alérgicos (epífora, secreciones, edema palpebral, quemosis conjuntival e hiperemia conjuntival). La olopatadina y la alcaftadina fueron mejores que el grupo de control, pero sin importancia estadística. El conteo de mastocitos no mostró diferencias importantes entre los grupos terapéuticos. (Ver Gráfica 1)

– Evaluaciones de fase tardía: con dos métodos se evaluaron los cambios en la cantidad de eosinófilos conjuntivales. Con tinción de un marcador específico para las proteínas principales de los eosinófilos y con tinción para contar el número de eosinófilos. La sensibilización y la exposición aumentaron significativamente los eosinófilos en la conjuntiva frente al grupo de control. Y se encontró que la alcaftadina inhibió significativamente la agregación de eosinófilos en la conjuntiva. (Ver Gráficas 2 y 3)

La expresión de ZO-1 y E-cadherina fue baja en los grupos S/C y NS/NC, pero la alcaftadina pudo prevenir mucho estas pérdidas. (Ver Gráficas 4 y 5)

Discusión y conclusiones

Con un modelo murino de conjuntivitis alérgica se examinaron los efectos de la alcaftadina y la olopatadina en concentraciones utilizadas clínicamente. En general, la sensibilización y la exposición al alérgeno indujeron una fuerte respuesta alérgica, con muchos signos y síntomas clínicos, así como en el aumento de la respuesta de los eosinófilos y la reducción de la expresión de los marcadores de ZO-1 y E-cadherina en las uniones herméticas.

La alcaftadina inhibió la agregación de eosinófilos de manera significativa y aunque se desconoce el mecanismo de esta acción única, se ha observado un antagonismo con los receptores H1, H2 y H4 de la histamina.¹² Se han descrito muchos efectos sobre los eosinófilos, incluyendo la quimiotaxis, con respecto a los efectos de la adhesión de la histamina en los receptores H4.¹⁶ El antagonismo de estos efectos por la alcaftadina podría reducir la infiltración de eosinófilos. Como estudios previos ya habían mostrado que la olopatadina es un potente estabilizador de los mastocitos,¹⁷ es improbable que la inhibición de los eosinófilos que tiene la alcaftadina se deba a una supresión extrema de la degranulación de los mastocitos.

Si los perfiles de estabilización de los mastocitos con los dos agentes activos son muy diferentes, estas diferencias también se presentarían en los signos y síntomas clínicos agudos. Pero como este no fue el caso, quizá la inhibición de los eosinófilos demostrada por la alcaftadina al 0,25% sea un efecto mediado por el amplio espectro del antagonismo de receptores de la histamina.

La alcaftadina también demostró que podía proteger los marcadores de las proteínas en las uniones herméticas epiteliales de la degradación basada en la inflamación alérgica. La exposición al alergeno conjuntival indujo una pérdida de la expresión de ZO-1 y E-cadherina en los grupos de control S/C y tratado con vehículo. Los niveles de los dos marcadores fueron superiores estadísticamente a los controles S/C en el grupo de alcaftadina al 0,25%.

Es posible que la prevención de la pérdida de las proteínas de unión hermética se relacione con la capacidad de la alcaftadina para prevenir la agregación de eosinófilos.

Después de la quimiotaxis, los eosinófilos liberan su contenido granular en el epitelio conjuntival.³ Se sabe que la liberación de productos celulares toxicas, incluyendo proteínas catiónicas y peroxidasas de los eosinófilos, causa daño tisular adicional, lo cual se observa clínicamente como la respuesta alérgica de fase tardia.³

Referencias

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 Tabla 1. Propiedades terapéuticas por grupo. (NS/NC, sin sensibilización al alérgeno, animales nunca expuestos; S/C, sensibilizados al alérgeno).

Gráfica 1. Evaluación de la fase aguda. Medidas de la respuesta aguda en el ensayo conjuntival modificado de reacción a alérgenos. A) Valores promedio de los síntomas sumados para cinco grupos de tratamiento. Los síntomas incluyen epífora, edema palpebral, quemosis conjuntival e hiperemia conjuntival. Los resultados en todos los grupos son muy diferentes de los no tratados (NS/NC, P< 0,001). B) Conteo de mastocitos de tres secciones consecutivas de tejido conjuntival observados bajo un campo de 200×. Sin diferencias significativas entre los grupos. Con barras de error se indica el error estándar en ambas gráficas. (Abreviaturas: NS/NC, sin sensibilización al alergeno (animales nunca expuestos); S/C, sensibilización, exposición; vehículo, sensibilización, exposición, solo vehículo del fármaco; olopatadina, sensibilización sensibilización, exposición, exposición, olopatadina tópica al 0,1%; alcaftadina, sensibilización, exposición, alcaftadina tópica al 0,025%).

Gráfica 2. Infiltración de eosinófilos de la conjuntiva. Las imágenes confocales de las secciones del tejido de cada grupo terapéutico tiñen con la proteína principal de los eosinófilos (verde) y con propidio yodo (rojo). A) Sin sensibilización, sin exposición (NS/NC); B) sensibilización, exposición (S/C); C) S/C + vehículo del medicamento; D) S/C + olopatadina tópica al 0,1%; E) S/C + alcaftadina tópica al 0.025%. La tinción a la proteína principal es más pronunciada en los animales sensibilizados y expuestos sin tratamiento farmacológico (B y C).

Gráfica 3. Cuantificación de la infiltración de los eosinófilos con tinción de Giemsa y hematoxilina eosina en tres secciones conjuntivales consecutivas. Los grupos S/C, vehículo y olopatadina presentan diferencias significativas con respecto a NS/NC (*P<0,01) pero no el grupo de alcaftadina. Los resultados de la olopatadina no son muy diferentes a los de S/C o el vehículo, pero la alcaftadina si es significativamente distinta de ambos tratamientos (‡P<0,01). El grupo de alcaftadina también presentó una diferencia importante con el grupo de olopatadina (†P<0,05). (Abreviaturas: NS/NC, sin sensibilización al alergeno (animales nunca expuestos); S/C, sensibilización, exposición; vehículo, sensibilización, exposición, solo vehículo del fármaco; olopatadina, sensibilización, exposición, olopatadina tópica al 0,1%; alcaftadina, sensibilización, exposición, alcaftadina tópica al 0,025%).

Gráfica 4. Etiqueta de las proteínas de unión en la conjuntiva. Tinción inmunofluorescente de ZO-1 (rojo) y E-cadherinas (verde) en secciones del tejido con las cinco clases de tratamiento. A) Sin sensibilización, sin exposición; B) sensibilización, exposición; C) sensibilización, exposición, solo vehículo del medicamento; D) sensibilización, exposición, olopatadina tópica al 0,1%; E) sensibilización, exposición, alcaftadina tópica al 0,025%. Nótese la reducción de la tinción en los animales sensibilizados y expuestos sin tratamiento farmacéutico (B y C).

Gráfica 5. La alcaftadina previene los cambios relacionados con la exposición conjuntival al alergeno en ZO-1 y E-cadherina en el epitelio conjuntival. Con imágenes confocales se calculó la expresión relativa de las proteínas de unión en los cinco grupos. La expresión de ZO-1 redujo significativamente la sensibilidad, el tejido expuesto al antígeno (S/C) en comparación con el tejido de control (5A, *P ≤ 0.05). La alcaftadina y la olopatadina evitaron esta reducción, pero solo los valores de la alcaftadina fueron significativamente diferentes a las del grupo S/C (**P ≤ 0.05). Las diferencias en la intensidad de la fluorescencia con la tinción de E-cadherina (5B) entre los grupos no expuestos y expuestos al antígeno no fueron significativas, pero el tratamiento mostró una tendencia a la baja que fue reversada en ambos grupos de tratamiento activo. La única comparación con un nivel de significancia fue el incremento visto en las muestras tratadas con alcaftadina con respecto al grupo de vehículo S/C + (***P ≤ 0,05). (Abreviaturas: NS/NC, sin sensibilización ni exposición (animales nunca expuestos); S/C, sensibilización, exposición; vehículo, sensibilización, exposición, solo vehículo del fármaco; olopatadina, sensibilización, exposición, olopatadina tópica al 0,1%; alcaftadina, sensibilización, exposición, alcaftadina tópica al 0,025%; ZO-1, ocludina zónula 1).

Background: Antihistamines constitute the first line of therapy for allergic conjunctivitis, and are safe and effective in relieving the signs and symptoms of ocular allergy. Despite this, they are less effective than some other drugs in relieving delayed symptoms of allergic conjunctivitis.

Recent evidence suggests that changes in the conjunctival epithelium may underlie aspects of delayed reactions. In this study we compared two antihistamines, olopatadine and alcaftadine, for their ability to modify epithelial cell changes associated with allergic conjunctivitis at time points selected to reflect late-phase reactions.

Methods: Studies employed a modified conjunctival allergen challenge model. Sensitized mice were challenged with topical allergen with or without drug treatments. Treatment groups were assayed for acute-phase (15 minutes) and delayed-phase (24 hours) responses. Groups were scored for allergy symptoms (redness, itch, tearing, and edema) and for conjunctival mast cell numbers. Delayed-phase groups were also examined for eosinophil numbers and for tight junctional protein expression.

Results: Olopatadine-treated and alcaftadine-treated animals had similar efficacy profiles and mast cell numbers, suggesting both were effective at ameliorating symptoms of the acute phase. In contrast, alcaftadine-treated animals had significantly lower conjunctival eosinophil infiltration than either controls or olopatadine-treated animals. Allergen challenge caused a significant decrease in expression of the junctional protein, ZO-1, and this decrease was prevented by alcaftadine but not by olopatadine.

Conclusion: Alcaftadine displays therapeutic properties beyond its antihistamine action. These include an ability to reduce conjunctival eosinophil recruitment, and a protective effect on epithelial tight junction protein expression.

16 ratones antes del tratamiento, ocho animales en la fase inicial del tratamiento (signos y síntomas clínicos, y densidad de los mastocitos) y ocho más en la fase tardía (agregación de eosinófilos, expresión de proteínas de unión hermética). Todos los animales se examinaron antes del estudio para asegurarse de que no hubiera una inflamación ocular preexistente.